近期，哈尔滨工业大学（深圳）陈华英课题组报道了一种利用连续微孔阵列实现单细胞低速精确聚焦的方法，并将该聚焦方法和实时图像识别结合起来，实现了在低雷诺数下单细胞的主动式分选。相关成果以“Passive Focusing of Single Cells Using Microwell Arrays for High- Accuracy Image-Activated Sorting”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上（DOI: 10.1021/acs.analchem.3c04195）。

——  背景介绍  ——

从混合细胞中高效的分离目标细胞在包括细胞谱系培养、疾病检测和治疗以及细胞疗法等领域都至关重要。例如从外周全血细胞中选择性分离循环肿瘤细胞，用以诊断以及评估癌症阶段和治疗效果；利用微流控技术，利用活细胞和死细胞的硬度差异将其分离，从而可以提高脐血样品中活细胞的纯度。

流式细胞分选技术由于高通量和易操作性而被广泛应用，这种方法常常包括三个步骤：（1）聚焦成线（2）细胞信号检测（3）根据信号进行分选和收集。细胞聚焦是其中非常重要的环节，其会极大的影响到后续单细胞检测和分选的准确程度。单细胞聚焦的方法分为主动式和被动式两大类型，主动式需要外加声光电磁热等物理场，可能会对细胞产生损伤。被动式大多利用流体特性进行聚焦，其通量比较大，但也存在着聚焦所需流速太大，聚焦不够精确，聚焦受流速影响大以及聚焦指标单一等等问题。

和聚焦技术一样，检测分选技术也存在着主动式和被动式两种，方法也较为类似。其中基于图像识别的检测分选方法由于能够提供细胞的形态细节而逐渐变的受欢迎。使用图像识别检测单细胞会对前面聚焦的过程产生非常高的要求。要求聚焦非常准确，这样才能放大显微倍数来准确识别细胞的形态细节。并且需要聚焦过程中流速不能太快，这样才不会对相机的性能产生过高的要求。

——  研究的主要内容  ——

图一：

图一 用于细胞高效聚焦和分选的微流控系统示意图。（A）微流控芯片（B） 用于细胞聚焦的微孔阵列（C）缩小的微球汇合区域，以及（D）具有分选通道、废液通道和收集通道的分选区域。微孔单元的（E）斜视图和（F）侧视图以及细胞的流动过程示意图。（来源：Analytical Chemistry）

图二：

图二 单个微孔仿真模型研究（A）斜视图和（B）俯视图中微孔模型流线图（C） 细胞在微孔单元中流动的时间序列图像（D）（E）表示离开孔微孔的细胞的临界Re与孔直径和深度的变化关系图

（来源：Analytical Chemistry）

图三：

图三 500 μm孔中20 μm微球聚焦效果和雷诺数关系研究（A）微球聚焦显微图像（Re=0.08）（B）从侧面进行轨迹成像的水平显微系统（C） 微球（侧视图）在 Re 为0.053 和 0.133 时从一个孔流向另一个孔。当Res为（D）0.08（E）0.133和（F）0.187时，微球在不同距离上行进的偏移距离箱线图。其中微孔的高度和深度均为50μm（来源：Analytical Chemistry）

图四：

图四 连接通道和球体尺寸对聚焦性能的影响研究（A）显微照片和（B）20 μm微球两种不同类型微孔中流动的聚焦情况（1000微米带连接微孔和1000微米不带连接微孔），其中Re为0.053。（C）聚焦的显微照片和（D）不同尺寸的微球在200 μm孔中流动33 mm的微球的聚焦情况，连接通道的Re为0.027，红点表示随时间推移通过区域的细胞。（E）15 μm和25 μm微球在微孔中流动的偏移距离（微孔直径500 μm，位置33mm处）（来源：Analytical Chemistry）

图五：

图五 K562 细胞在微孔大小为 500 μm 的微流控装置中的聚焦。（A） 聚焦细胞在 Re 为 0.027 时流动距离为 33 mm 的显微照片。（B） 细胞运动33mm后，其雷诺数和偏移距离的关系（来源：Analytical Chemistry）

图六：

图六 利用多重微孔实现微球的聚焦。（A） 显微照片和 （B） 20 μm球体在 5 个不同位置的聚焦散点图，Re 为 0.08。蓝色的点表示分布在对称平面上的微球。（C）20 μm球体在Re和偏移距离的关系（最后一个微孔中）。（D） 当Re为0.027时，孔阵列末端K562细胞的显微照片。（E） K562细胞Re和偏移距离的关系（最后一个孔中）。（来源：Analytical Chemistry）

图七：

图七 使用微孔阵列聚焦后通过图像识别实现对单个 K562 细胞的分选。（A）小（12.8μm）和（B）大（13.8μm）细胞在识别区域（左）、分选区域附近（中）和废物/样品出口（右）流动，通过算法实现对大于 13 μm 的细胞的收集。（来源：Analytical Chemistry）

——  小结  ——

本研究报道了一种低雷诺数下利用微孔实现单细胞精确聚焦，并通过图像识别进行主动式分选的聚集方法。数值模拟表明，微孔中收敛的流线有助于聚焦效应。实验表明，微球和细胞可以分别在0.08和0.027的雷诺数下排列成一条直线。连接微通道、流动长度和粒径对聚焦性能有显著影响。设计的锥形微孔阵列证明了将球体/细胞聚焦在宽通道中扩散到直线的能力。最后，通过我们课题组自己设计的图像识别算法来自动分选不同大小的微球/K562细胞，通量为每秒一个细胞，准确率为97%。该技术在低雷诺数下具有优异的性能，在单细胞分选领域具有广泛的应用潜力。

目前课题组已将相关技术开发成基于实时图像处理的单细胞分选和打印技术（CytoChoice 2.0）,该设备可以实现细菌、微藻、细胞、微粒、水包油液滴、精子和类器官等各种微小粒子的分选打印。单粒子打印效率99%以上，细胞活性能达到98%。该设备集成显微成像、2500万像素相机 （150fps），快速实时图像分析和处理算法，而且芯片可以根据需求更换，实现更多复杂功能。该设备的无标记分选打印技术将为生物医药领域提供新的研发和生产手段。

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